Agro Food Lab

Campylobacter

Campylobacter is een geslacht bacteriën die van nature voorkomen bij verschillende soorten dieren als pluimvee, vogels, rundvee, schapen, geiten, varkens, vliegen, ongedierte en huisdieren. De meest voorkomende Campylobacter soorten zijn de Campylobacter jejuni en de Campylobacter coli. Daarnaast komt Campylobacter van nature ook voor in grondwater en oppervlaktewater. Dieren kunnen deze ziekte bij zich dragen zonder daar zelf ziek van te worden. Bij mensen kan Campylobacter leiden tot voedselinfectie of in zeldzame gevallen tot ernstigere ziektes zoals bijvoorbeeld reactieve arthritis of het Guillain-Barré Syndroom. Om ziekte gevallen bij de mens te voorkomen moet ervoor gezorgd worden dat Campylobacter niet op ons voedsel terecht komt. Het Agro Food Lab voert analyses uit waarbij wij de aanwezigheid van Campylobacter kunnen aantonen en kunnen we de hoeveelheid aanwezige Campylobacter bacteriën tellen.

Het aantonen van de aanwezigheid van Campylobacter

Bij de detectie van Campylobacter wordt de aanwezigheid van Campylobacter aangetoond. Afhankelijk van het type monster kan het monster direct op een petrischaaltje met mCCDA medium worden gebracht of moet het monster eerst worden voorbewerkt met vloeibaar medium en een dag in de broedstoof worden geplaatst. Vervolgens worden ook deze monsters op een petrischaaltje gebracht. De petrischaaltjes met monstermateriaal erop moeten 2 dagen in de broedstoof. Indien er kenmerkende groei heeft plaats gevonden van Campylobacter bacteriën kan de Campylobacter bevestiging uitgevoerd worden.

Listeria

Listeria is een groep bacteriën die op veel verschillende plekken voor kan komen, zoals in het water, in de grond, in dieren of gewassen. Listeria kan zorgen voor tot ziekte bij de mens. Indien gezonde mensen besmet raken met Listeria zal dit vaak leiden milde griepverschijnselen en soms kan het zelfs verlopen zonder dat iemand er klachten van heeft. Bij mensen met een verzwakte afweer, ouderen, kinderen en zwangere vrouwen kan Listeria ernstig verlopen. De ziekteverschijnselen kunnen dan uiteenlopen van hersenvliesontsteking, bloedvergiftiging of miskramen. In sommige gevallen kan Listeria besmetting zelfs een dodelijke afloop hebben. Er zijn 6 verschillende bacteriën die onder het Listeria geslacht vallen, maar alleen de Listeria monocytogenes is ziekmakend voor de mens. Kenmerkend voor Listeria is dat het kan groeien bij 4°C en dus kan de bacterie doorgroeien in de koelkast.

Het aantonen van de aanwezigheid van Listeria in levensmiddelen of omgevingsmonsters kan op ons lab op verschillende manieren gebeuren. De bevestiging en telling van Listeria kan aangetoond worden door het monstermateriaal op een petrischaal met RLM (Rapid L mono) medium aan te brengen en te bebroeden. Een andere methode is een stuk sneller, dit is namelijk de PCR methode, waarbij specifiek het DNA van Listeria aangetoond word.

Het aantonen van Listeria via de DNA methode (uitslag de volgende werkdag)

Om op een snelle manier na te gaan of de Listeria bacterie aanwezig is in een monster kan er gebruik gemaakt worden van de DNA methode. Met deze methode wordt het DNA van Listeria gedetecteerd. Net als de mens bevat een bacterie DNA. Het DNA van de Listeria bacterie is uniek, net als bijvoorbeeld een vingerafdruk uniek is voor elk mens. Met behulp van de real-time PCR, een apparaat dat DNA kan meten, kan het stukje DNA dat uniek is voor Listeria bacteriën aangetoond worden. Deze test kan worden uitgevoerd voor alle 6 verschillende Listeria types of specifiek voor Listeria monocytogenes. Voordat het monstermateriaal in het PCR apparaat gebracht kan worden moet het eerst worden voorbewerkt. De manier van voorbewerken is afhankelijk van het type monster. Het monster moet vervolgens ongeveer 18 uur in een broedstoof geplaatst worden zodat de eventueel aanwezige Listeria bacterie zich kan vermeerderen. Na het bebroeden van het monster vindt er nog een voorbehandeling plaats voordat het monster op de PCR gebracht kan worden. Deze voorbehandeling is nodig om het Listeria DNA uit de bacterie vrij te krijgen. In de PCR wordt uiteindelijk gemeten of de Listeria bacterie aanwezig is of niet. Nadat de meting is verricht volgt er een positieve of negatieve uitslag.

Salmonella

Salmonella is een geslacht bacteriën die van nature voorkomen in de darmen van dieren, zoals bijvoorbeeld varkens, pluimvee, runderen, ongedierte en huisdieren maar Salmonella kan ook voorkomen bij koudbloedige dieren zoals reptielen. Dieren die Salmonella met zich mee dragen zullen hier niet ziek van worden, maar zodra een mens in aanraking komt met Salmonella kan dit wel leiden tot ziekte. De ziekte zal meestal een voedselinfectie zijn, maar kan ook zeer ernstige ziektebeelden veroorzaken. De ernst van de infectie is afhankelijk van het type Salmonella en de weerstand van de patiënt. De meest ziekmakende types Salmonella’s zijn Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium. Het is van belang om de besmetting van voedsel met Salmonella te voorkomen. Het Agro Food Lab is gespecialiseerd in het aantonen van Salmonella in alle voedingsmiddelen, maar ook in omgevingsmonsters en mest.

Het aantonen van de aanwezigheid van Salmonella

Voor de detectie van Salmonella gebruiken wij verschillende methodes. De aanwezigheid van Salmonella kan aangetoond worden met twee verschillende methodes, namelijk een grensreactie (bepaling van de aanwezigheid van een bacterie) waarbij de Salmonella eerst wordt opgekweekt waar vervolgens een  biochemische bevestiging  van plaats vindt of de bevestiging van de aanwezigheid van Salmonella DNA (erfelijk materiaal) via de PCR methode. Nadat de aanwezigheid van Salmonella is aangetoond is het van belang om na te gaan om welk type Salmonella het gaat en dit wordt gedaan via een zogenaamde serotypering. Er bestaan namelijk meerdere varianten van Salmonella en het ziekmakend vermogen van Salmonella verschilt per type.

Salmonella PCR methode – Het aantonen van Salmonella via de DNA methode
(uitslag de volgende werkdag)

Om op een snelle manier aan te tonen of er een besmetting met Salmonella heeft plaatsgevonden in een monster (sample, testmateriaal) kan er gebruik gemaakt worden van de PCR methode. Bacteriën bevatten net als mensen DNA en net als bij de mens is het DNA van een bacterie net zo uniek als iemands vingerafdruk. Met behulp van de real-time PCR (Polymerase Chain Reaction, een apparaat waarbij de aanwezigheid van een specifiek stukje DNA gemeten kan worden) kan het unieke stukje DNA dat typerend is voor de Salmonella bacterie aangetoond worden.

Voordat er met de PCR begonnen kan worden moet er eerst een test portie opgekweekt worden. Er wordt dan een medium (een medium is een vloeistof of vaste stof met daarin allerlei specifieke ingrediënten die bacteriën nodig zijn om te groeien. Deze ingrediënten kunnen ook specifiek zijn voor één bepaald soort bacterie), genaamd BPW (Buffered Peptone Water), toegevoegd aan de test portie om de aanwezige bacteriën te kunnen laten groeien.

Na ongeveer 18 uur kan de suspensie die hieruit ontstaat gebruikt worden voor de PCR. Voordat het monster in de PCR geplaatst kan worden vindt er nog een voorbehandeling plaats om het DNA uit de bacteriën te isoleren.

In de PCR machine wordt het DNA van Salmonella gedetecteerd. Indien er geen Salmonella aanwezig is in het monster zal er een negatieve uitslag volgen. Als er wel Salmonella wordt aangetoond dan volgt er een positieve uitslag en vervolgens is het dan nog nodig om een serotypering uit te voeren om aan te tonen met welk type Salmonella het monster is besmet.

Wet Pooled sampling (WPS)

Om kosten te besparen kan er op het Agro Food Lab gebruik gemaakt worden van de zogenaamde wet pooled sampling voor de PCR detectie van Salmonella. De wet pooled sampling geldt enkel voor de vlees- en vleesproducten. Bij wet pooled sampling worden 5 monsters samengevoegd tot één monster. Dit gepoolde monster wordt vervolgens op de PCR gedraaid. Indien de uitslag negatief is, geldt dit gelijk voor alle 5 monsters. Indien de uitslag positief is zal de test herhaald worden voor elk monster los van elkaar om uit te zoeken welk monster positief is. Op deze manier kan er 30% tot 40% van de kosten bespaard worden.

Salmonella

Salmonella is een geslacht bacteriën die van nature voorkomen in de darmen van dieren, zoals bijvoorbeeld varkens, pluimvee, runderen, ongedierte en huisdieren maar Salmonella kan ook voorkomen bij koudbloedige dieren zoals reptielen. Dieren die Salmonella met zich mee dragen zullen hier niet ziek van worden, maar zodra een mens in aanraking komt met Salmonella kan dit wel leiden tot ziekte. De ziekte zal meestal een voedselinfectie zijn, maar kan ook zeer ernstige ziektebeelden veroorzaken. De ernst van de infectie is afhankelijk van het type Salmonella en de weerstand van de patiënt. De meest ziekmakende types Salmonella’s zijn Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium. Het is van belang om de besmetting van voedsel met Salmonella te voorkomen. Het Agro Food Lab is gespecialiseerd in het aantonen van Salmonella in alle voedingsmiddelen, maar ook in omgevingsmonsters en mest.

Het aantonen van de aanwezigheid van Salmonella

Voor de detectie van Salmonella gebruiken wij verschillende methodes. De aanwezigheid van Salmonella kan aangetoond worden met twee verschillende methodes, namelijk een grensreactie (bepaling van de aanwezigheid van een bacterie) waarbij de Salmonella eerst wordt opgekweekt waar vervolgens een  biochemische bevestiging  van plaats vindt of de bevestiging van de aanwezigheid van Salmonella DNA (erfelijk materiaal) via de PCR methode. Nadat de aanwezigheid van Salmonella is aangetoond is het van belang om na te gaan om welk type Salmonella het gaat en dit wordt gedaan via een zogenaamde serotypering. Er bestaan namelijk meerdere varianten van Salmonella en het ziekmakend vermogen van Salmonella verschilt per type.

Grensreactie met biochemische bevestiging van Salmonella MSRV-methode(uitslag bekend tussen 3 tot 8 werkdagen)

Wanneer wij op het Agro Food Lab een test portie binnen krijgen die we gaan testen op de

aanwezigheid van Salmonella kunnen wij gebruik maken van de biochemische bevestiging. Het monster zal eerst aan de test portie BPW medium toegevoegd worden waarin eventuele aanwezige Salmonella en andere bacteriën kunnen groeien en zichzelf dus vermeerderen. Het monster moet vervolgens een dag in een broedstoof (en verwarmde kast, ingesteld op een specifieke temperatuur) staan zodat de eventueel aanwezige Salmonella bacterie voldoende tijd heeft om zich te vermeerderen.

De volgende stap is een selectieve ophoping van de Salmonella bacterie, zodat voornamelijk de eventueel aanwezige Salmonella bacterie zich zal vermeerderen en eventuele andere bacteriën aanwezige niet of in mindere mate. Het monster wordt overgebracht naar 3 verschillende soorten media die ingrediënten bevatten die specifiek zijn voor de groei van Salmonella. Deze drie media zijn de MSRV (Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis) medium, MKTTn (Muller-Kaufmann tetrathionate novobiocine) medium of RVS (Rappaport-Vassiliadis medium met Soya) medium.

Voor MRSV medium kan na een dag in de broedstoof beoordeeld worden of het monster verdacht is van Salmonella. Indien dit niet het geval is wordt het monster nogmaals een dag bebroed en wordt het monster nogmaals beoordeeld. In sommige gevallen kan het zijn dat er na 2 dagen bebroeding een verdacht groei heeft plaats gevonden. Als er na 2 dagen bebroeden geen verdachte groei heeft plaats gevonden volgt vervolgens een negatieve uitslag. Alle verdachte samples zullen verder onderzocht worden door ze over te enten op BGA of XLD media, zoals hieronder beschreven.

Bij gebruik van de MKTTn of RVS media wordt het monster overgebracht in een reageerbuis met daarin MKTTn of RVS media. Deze buis wordt een dag in de broedstoof bebroed. Vervolgens wordt het monster overgebracht op XLD en BGA media, zoals hieronder beschreven.

Indien het monster verdachte groei vertoont op MSRV of indien het monster overgebracht is naar MKTTn of RVS media wordt het monster verdeeld over twee petrischalen (steriele plastic schalen [afbeelding petrischaal] van twee verschillende media, namelijk XLD (Xylose Lysine Desoxycholaat) en BGA (Briljant Green Agar). De monsters worden op de XLD en BGA petrischaaltjes overgeënt en vervolgens wordt het een dag bebroed in de broedstoof. Indien het monster daadwerkelijk een Salmonella bacterie bevat zal er kenmerkende groei op deze platen te zien zijn. Indien de specifieke groei niet aanwezig is zal er een negatieve uitslag volgen.

Indien het monster op deze plaat ook verdacht lijkt te zijn in de verschillende media zal de biochemische detectie reeks ingezet worden. Hierbij wordt het monster in drie verschillende buizen verdeeld waarin de specifieke eigenschappen van Salmonella aan het licht zullen komen omdat de buizen van kleur veranderen door de biochemische reacties die Salmonella tot stand kan brengen. De buizen worden een dag bebroed voordat het beoordeeld kan worden. In de eerste buis zit TSI agar (Triple-Sugar-Ironagar), en de Salmonella bacterie kan hier verschillende veranderingen in aanbrengen, zoals een verkleuring van rood naar zwart (vorming van zwavelwaterstof), gasvorming (door fermentatie van suiker) en een rode of gele kleur in het schuine gedeelte (afhankelijk van de fermentatie van verschillende suikers). In de tweede buis zit ureum agar en hier kan de Salmonella een kleuromslag van geel naar roze/rood veroorzaken (door de urease activiteit van de bacterie). De laatste buis bevat LDC (Lysine-decarboxylase medium), dit heeft een heldere paarse kleur. Indien Salmonella aanwezig is zal de buis na de incubatie paars van kleur zijn (door lysine decarboxylatie activiteit), maar wel een beetje troebel worden door de groei van de bacterie. Indien Salmonella niet aanwezig is kan de kleur veranderen naar geel.

Indien de test positief wordt bevonden op de aanwezigheid van Salmonella is het van belang om na te gaan om welk type Salmonella het gaat. Deze Salmonella zal verder onderzocht worden via de serotypering.

PCR methode voor Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (PCR Se/St)

Het Agro Food Lab beschikt ook over een PCR methode waarin naast de Salmonella species (alle soorten Salmonella) specifiek de Salmonella stammen Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium aangetoond worden. Alle overige Salmonella stammen worden met deze methode niet gemeten. De opwerking van de monsters voor deze methode is hetzelfde als beschreven bij de “Salmonella PCR methode”. De Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium zijn de meest ziekmakende Salmonella stammen en deze methode kan snel aantonen of een Salmonella besmetting van een product één van deze stammen betreft. Deze methode kan direct na de “Salmonella PCR methode” uitgevoerd worden om dezelfde dag de resultaten te verkrijgen. Indien het echter alleen interessant is om de Salmonella enteritidis of Salmonella typhimurium aan te tonen in een monster kan er ook voor worden gekozen om enkel deze test uit te voeren.

Serotypering van Salmonella

Om na te gaan met welk type Salmonella een monster besmet is zal er een serotypering worden uitgevoerd. Voordat dit gedaan kan worden moet er een rein cultuur (een kolonie van een bacterie zonder vervuiling van andere bacteriën) gemaakt worden van de Salmonella. Het monster wordt dan overgeënt over een petrischaal met een specifiek medium zodat Salmonella kan groeien. Nadat de Salmonella in de petrischaal is gegroeid kan er een losliggende kolonie (wanneer één enkele bacterie zich zal vermenigvuldigen ontstaat er een kolonie van bacteriën met daarin miljoenen dubbelgangers, deze is met het blote oog zichtbaar op bijvoorbeeld een petrischaaltje) gekozen worden voor de serotypering. Meestal kan na het inzetten van de biochemische reeks de TSI buis gebruikt worden voor de serotypering.

Met behulp van antistoffen die specifiek zijn voor een bepaalde type Salmonella bacterie kan aangetoond worden om welk type Salmonella het gaat. Er zijn ongelooflijk veel verschillende types Salmonella. In ons laboratorium testen wij op de meest voorkomende types Salmonella. Deze zijn onder andere: Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi B var. Java, Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella virchow, Salmonella hadar, Salmonella mbandaka, Salmonella livingstone, Salmonella indiana.

Shiga toxin-producing Escherichia Coli (STEC)

De bacterie Escherichia coli (E. coli) bevindt zich van nature in de darmen van mensen en dieren. De E. coli bacterie zal bij de mens niet altijd zorgen voor ziekte. Er zijn echter varianten van de E. coli die wel ziekte kunnen veroorzaken bij de mens. Een ziekmakende variant van de E. coli is de Shiga Toxin-Producing Escherichia Coli (STEC) en deze bacterie kan toxinen (giftige stofjes die een bacterie kan produceren en af kan geven aan zijn omgeving, bijvoorbeeld de bloedbaan van een mens) produceren die kunnen leiden tot ziektes als hemorragische colitis (bloederige en/of waterige diarree) en in sommige gevallen tot de ernstige hemolytisch-uremisch syndroom (HUS) (een syndroom met afbraak van rode bloedcellen, acuut nierfalen en verlaagde bloedplaatjes) dat zelfs kans geeft op het overlijden van de patiënt. Om deze problemen te voorkomen kan een product getest worden op de aanwezigheid van STEC bacteriën. Indien een STEC bacterie aanwezig blijkt te zijn in een product kan er vervolgens een test uitgevoerd worden om het serotype (specifiek subtype van een bacterie) van de bacterie te bepalen. De serotypes met het O-gen zijn de ziekteverwekkende varianten van STEC en het kan in sommige gevallen noodzakelijk zijn om aan te tonen om welke subtype het gaat.

Het aantonen van Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC)
(uitslag de volgende werkdag)

Om na te gaan of STEC aanwezig is in een monster kan er gebruik gemaakt worden van de PCR methode. Bacteriën bevatten net als de mens DNA, en dit DNA is net als bij de mens uniek. Met behulp van een apparaat dat DNA kan meten, de PCR, kan de aanwezigheid van STEC in een monster aangetoond worden. Voordat het monstermateriaal op de PCR gebracht kan worden moet er eerst een voorbehandeling plaatsvinden. Na de voorbehandeling moet het monster eerst 10 tot 22 uur (afhankelijk van het type monster) bebroed worden in de broedstoof zodat de bacterie zich kan vermeerderen. Na de bebroeding vindt er nog een kleine voorbehandeling plaats in het laboratorium om het STEC DNA vrij te krijgen uit de bacterie. Vervolgens wordt het monster op de PCR gebracht. Indien de STEC bacterie wel of niet aanwezig is volgt er een positieve of negatieve uitslag.

Indien gewenst kan vervolgens het serotype van de bacterie bepaald worden. Bij de serotypering wordt er getypeerd op de 7 belangrijkste subgroepen in de STEC, namelijk O26, O45, O103, O111, O121, O145 en O157:H7 met behulp van de PCR. De subtypes van STEC kunnen ook via een biochemische methode bepaald worden.